Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)是Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)的升级版，与前代Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase相比，本产品具有更强的残留物耐抑制性、更快的逆转录速度以及更高的逆转录产量，适用于动物、植物以及微生物RNA的逆转录反应。其中的gDNA digester Mix -V2的残留DNA消化能力大幅提升，可消化达1000 ng的DNA，更放心地避免了RNA模板中残留的DNA污染，保证后续结果更加可靠。Hifair® AdvanceFast SuperMix含有逆转录反应所需的所有组分，只需加入RNA模板和RNase-free H2O即可进行逆转录反应，并同时终止gDNA digester的作用，保证cDNA的完整性。
本产品逆转录产物适用于染料法和探针法qPCR，不适用于后续基因克隆等长片段扩增，如果需要，推荐太阳成集团Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat#11149ES、Cat#11150ES)进行高效逆转录。
产品组分
| 组分编号 | 组分名称 | 11155ES10 | 11155ES60 |
|---|---|---|---|
| 11155-A | Hifair® AdvanceFast SuperMix | 60 μL | 600 μL |
| 11155-B | gDNA Digester Mix -V2 | 20 μL | 200 μL |
| 11155-C | RNase free H2O | 200 μL | 1 mL×2 |
- 快速简单：反转录时间5分钟，总计7分5秒
- 高效合成：cDNA得率更高，Ct值更小
- 高灵敏度：可检测低至10 pg的RNA
- 稳健保障：对于降解RNA和含抑制物的RNA仍可获得高cDNA得率
- 更多消化：能够消化更多的残留DNA
- 稳定可靠：产物可常温放置7天，试剂可反复冻融30次
- 反转录时间5分钟，总计7分5秒
第一链cDNA合成时间短，累计耗时约7分钟。比较了不同产品的cDNA合成程序，太阳成集团11155ES所需要的反应时间最短，并且在高温下进行反转录，避免了RNA复杂二级结构的影响。
- cDNA得率更高，CT值降低
针对不同物种不同GC含量的靶标，表现出更高的cDNA合成效率。针对不同样本的RNA，使用不同反转录试剂按照各自说明书规定的程序进行cDNA合成，后续使用太阳成集团染料法qPCR试剂进行qPCR。数据表明，相比于其他反转录试剂，11155ES可获得更高的cDNA得率，CT值会更小。
- 可检测低至10 pg的RNA
可检测低至10 pg的RNA。将293T细胞RNA(a)和拟南芥RNA(b)连续梯度稀释，使用11155ES进行cDNA合成。在RNA起始范围(从10 pg到1 μg)内，相关系数R2仍可达到0.99，效率高达96.4%(293T细胞)和100%(拟南芥)。
针对不同投入量的RNA，表现出更高的灵敏度。将293T细胞RNA和拟南芥RNA连续梯度稀释，使用不同反转录试剂按照各自说明书规定的程序进行cDNA合成，后续太阳成集团染料法qPCR试剂进行qPCR。△CT( CT (各反转录产品) – CT (11155ES))表明，相比于其他反转录试剂，11155ES在不同RNA投入下多表现更佳。
- 对于降解RNA和含抑制物的RNA仍可获得高cDNA得率
针对降解的RNA，有出色的能力保障合成。使用不同程度降解的293T细胞RNA进行cDNA合成，使用不同反转录试剂按照各自说明书规定的程序进行cDNA合成，后续太阳成集团染料法qPCR试剂进行qPCR。Δ CT 值 (Δ CT = CT (各反转录产品) – CT (11155ES))表明，相比于其他反转录试剂，11155ES可获得更高的cDNA得率和更低的CT值。
针对含有抑制物的RNA，有出色的能力保障合成。在含有不同抑制剂的反应中，使用100 ng 293T细胞RNA进行cDNA合成。使用不同反转录试剂按照各自说明书规定的程序进行cDNA合成，后续使用太阳成集团染料法qPCR试剂进行qPCR。数据表明，在抑制剂存在的情况下，11155ES可获得更高的cDNA得率和更低的CT值。
- 能够消化更多的残留DNA
能有效消化去除gDNA。以1000 ng人293T细胞DNA为模板，使用不同反转录试剂按照各自说明书规定的程序进行消化和反转录，同时设置不进行gDNA消化的实验组。后续使用太阳成集团11185ES进行qPCR。数据显示，试剂可对gDNA进行有效消化。
- 产物可常温放置7天，试剂可反复冻融30次
合成产物于不同环境存储，仍能保持一定的稳定性。将11155ES合成得到cDNA产物分别在-80℃、-20℃、4℃、25℃和37℃放置1-7天。后续使用太阳成集团染料法qPCR试剂进行qPCR。数据显示，相较于-80℃，其他环境保存下得到的CT值相差不大，不超过0.5个CT。
合成产物于不同环境存储，仍能保持一定的稳定性。将11155ES合成得到cDNA产物分别在-80℃、-20℃、4℃、25℃和37℃放置1-7天。后续使用太阳成集团染料法qPCR试剂进行qPCR。数据显示，相较于-80℃，其他环境保存下得到的CT值相差不大，不超过0.5个CT。
-25℃ ~ -15℃保存，有效期1年。逆转录产物可立即用于后续反应，也可4℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-20℃保存，避免反复冻融。
1. 反转录时是否需要加入额外的引物？
该产品后续用于常见RNA的qPCR，在反转录预混液中已添加一定比例的随机引物N6和Oligo dT，不需要加额外的引物。若后续进行小RNA或者环状RNA等特殊RNA的qPCR或长片段PCR，建议使用引物分开的反转录试剂盒11139ES或11149ES。
2. 用之前如何混匀试剂？
针对分子酶试剂，上下颠倒混匀后，轻微离心即可。不建议剧烈震荡混匀。
3. 11155ES能够兼容的RNA投入量范围？
11155ES可以兼容10 pg-5 μg的RNA投入量。但是过高的RNA投入量不一定能使Ct值更加靠前，过高的自提RNA投入随之带来的还有残留的其他成分，该抑制成分留在反转录产物中可能会抑制后续qPCR反应，出现Ct值变大或者曲线抖动或者沉淀产物，最终还是要稀释cDNA使用以达到最终结果。
4. 可否选用更长的反转录时间？
不建议选用更长的反转录时间，选用更长时间可能会导致Ct值延后，建议采用说明书建议的程序。
5. 反转录完成后，是否可以长时间置于PCR仪器中？
针对PCR仪器要做好设置，建议在85℃灭活后，设置4℃ 无穷时间∞，以防反应完成后，忘记取出，PCR上百度热盖通过热传导使产物处于高温加热状态。
6. 反转录完成后，需要通过浓度测定，将浓度调整至一定水平再进行荧光定量PCR么？
不需要。反转录产物通常是一个混合物，除了cDNA产物外，还有残余的RNA、蛋白、盐离子、dNTP等等，其中dNTP对于微量分光光度计的测定干扰大，最终对产物测定得到的数值不是产物的浓度。等量水平已在反转录前控制加入等质量的RNA环节中完成了。
7. 反转录完成后，产物忘记及时使用且并未放回冰箱，是否会对实验有影响？
该产品的产物经测试可在常温中放置一周且无影响。故可以继续使用完成后续实验。
8. 试剂打开后，若未用完，是否可以放在4℃环境中？
打开后，确保试剂未受到枪头交叉污染情况下，可放在4℃中，但建议尽量于2周内用完。
9. 后续荧光定量PCR时，搭配该试剂，建议选用哪款？
建议搭配11188-11190ES。
