本产品用于动物组织裂解以获取完整的细胞核。所获得的细胞核可以用于后续ATAC或者CUT&Tag实验。

一、 操作步骤

2.1 溶液配置（以下配置的体积为单个样本反应的用量，若有多个样本同时实验，需根据样本量修改配置体积，本试剂配置量已考虑了试剂损耗，多样本配置无需额外计算损耗）

1）取出4 x NIB、NPB-A、10mM PMSF（自备）、1M DTT（自备）、100x蛋白酶抑制剂（自备）于冰上放置；

2）1 x NIB : 2.25 mL /样本，750 μL 4 x NIB +6 μL 10 mM PMSF+3 μL 1M DTT+30 μL100x蛋白酶抑制剂，加入2211 μL ddH₂O，混匀（推荐现配现用）。

3）NPB-B : 500 μL /样本，230 μL 1 x NIB + 345 μL NPB-A，混匀（推荐现配现用）。

4）消化液：1mL Hank's 平衡盐溶液（HBSS）+5* μL 胶原酶（100mg/mL）

【注】: 1、以上buffer建议现配现用，请根据实际样本数量现配现用，配制的buffer冰上放置。

      2、PMSF、DTT浓度如和说明书中的浓度不一致，配制1xNIB时保证终浓度一致，更改H₂O的体积即可。

      3、* 不同组织用的胶原酶种类和胶原酶浓度会存在差异，可根据实际的组织更换胶原酶种类及使用浓度。

2.2组织消化 （选做）

【注】：该步骤只针对研磨工具使用匀浆器，并且难磨的组织 (如肌肉）可以使用胶原酶进行消化；其他组织可直接进行2.3步骤组织裂解。

实验开始前，请将离心机4℃预冷，实验全程在冰上操作。

1、将新鲜或者冻存组织放在冰上解冻，用PBS清洗干净。

2、将清洗干净的组织在Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中剪碎至1-2 mm，放置含有1 mL 消化液的离心管中，37℃ 孵育10 min。

3、立即将消化后的组织放置干净的Hank's 平衡盐溶液（HBSS）清洗1-2遍，然后进行组织裂解。

2.3 组织裂解

【注】：匀浆器或液氮研磨步骤选其一即可。

1）选用匀浆器：在预冷的组织匀浆器中先加入1.5 mL 1 x NIB，再加入新鲜或冻存动物组织（15 mg左右）或消化后的组织，冻存组织需冰上解冻5min；匀浆，Loose 10次，Tight 10次。

【注】：不同匀浆器及不同组织匀浆次数会稍有差异，需根据实际的组织及匀浆器确定研磨次数。

2）选用液氮研磨：将新鲜或冻存的组织取绿豆粒大小（40 mg 左右）放入装有液氮的研钵中，进行研磨至粉末状，然后放置装有1.5 mL 1 x NIB 溶液的管子中，轻柔震荡混匀或上下颠倒混匀。

【注】组织投入量可根据样本类型核经验调整。研磨过程尽量快速，避免液氮完全挥发完导致样本冻融或降解。

3）将上述步骤中的匀浆液通过70 μm细胞筛去除碎片，悬液转移至新的1.5ml离心管中。

4）2000 g，4℃离心5 min。

5）小心去除上清，加入500 μL1 x NIB进行重悬。

6）取500 μL NPB-A至新的2.0 mL 离心管中，再吸取500 μL NPB-B沿着管壁缓慢加入至NPB-A的上层，接着再将步骤5中的500 μL 悬液沿着管壁缓慢加入NPB-B的上层，此时溶液分为三层。

7）500 g，4℃离心10 min。

8）上层溶液与NPB-B之间的白色核带即为细胞核层（如右图所示），用200 μL 移液枪取白色核带至新的离心管中，加入1mL 1 x PBS溶液，轻轻吹打混匀，该溶液即为细胞核悬液。

【注】:吸取白色核带层，切勿吸取到杂质。

9）取10 μL 细胞核悬液进行荧光及台盼蓝染色，用于细胞核计数及显微镜观察。

10）立即进行后续实验。

• 细胞器残留比例更少
• 细胞核更纯净

2~8℃保存。