microRNA是一类被广泛关注的非编码RNA，长度为22 nt左右，对植物和动物的基因表达有着非常重要的调控作用。本试剂盒采用加A尾法来进行miRNA第一链cDNA的反转录，产品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加A尾反应和逆转录反应的所有原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3'末端的Poly(A)修饰过程和逆转录过程同时高效进行。后续qPCR中只需设计特异性正向引物，配合试剂盒中的通用反向引物，即可对样本中的miRNA进行检测。此外，试剂盒中提供了人、大鼠、小鼠通用的 U6 内参上下游引物，可在宽广的区域内得到良好的标准曲线。
本产品推荐与本公司的Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix（Cat#11171）配套使用，以获得最优的实验结果。
产品组分
| 组分编号 | 组分名称 | 11148ES10(10 T) | 11148ES50(50 T) |
|---|---|---|---|
| 11148-A | Hifair® miRNA RT enzyme mix | 17.5 μL | 87.5 μL |
| 11148-B | 2×Hifair® miRNA RT buffer | 50 μL | 250 μL |
| 11148-C | RNase-free H2O | 2 mL | 10 mL |
| 11148-D | Universal Reverse Primer (10 μM) | 800 μL | 4 mL |
| 11148-E | U6 Forward Primer (10 μM) | 100 μL | 500 μL |
| 11148-F | U6 Reverse Primer (10 μM) | 100 μL | 500 μL |
- 灵敏度高：模板为总RNA，灵敏度达10 pg；模板为miRNA，灵敏度不低于60个拷贝
- 特异性好：高特异性，能区分同家族miRNA间单个碱基差异
- 稳定性好：试剂在 37℃放置7 d；冻融稳定50次；配置体系在25℃保留48 h后，效果不受影响
逆转录温度和时间：37℃，50 min；灭活温度和时间：85℃，5 sec
图. 以293T RNA为模板，逆转录温度分别设置为37℃/42℃，逆转录时间分别为50/60 min，在85℃/95℃的灭活温度下分别灭活5 sec/60 sec/3 min/5 min，获得的cDNA用qPCR检测has-miR-let-7b-5p的表达情况。可选择逆转录温度和时间：37℃，50 min；灭活温度和时间：85℃，5 sec。
- 高特异性，能区分同家族miRNA间单碱基差异
图. 人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA，彼此间相差的碱基很少，甚至只有单碱基的差异。每个Let-7亚型（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）的人工合成miRNA使用 Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录合成cDNA，以不用的引物，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别扩增这些miRNA，利用公式2-ΔCT x 100%计算匹配率。结果显示，可有效区分密切相关的亚型家族成员。
冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。
Q: 试剂盒中的下游通用引物序列是什么？
A: 下游通用引物是保密的。当前市面上常见到的加A法反转录试剂中，加上的带A序列是不一样的，均是根据自己的加尾酶设计并完善的，出于专利保护所以不做公开。
Q: 试剂中的U6引物和通用反向引物是干什么用的？
A: U6是miRNA的内参，提供的引物可用于后续荧光定量检测。通用反向引物可以让您后续qPCR中，只需设计特异性正向引物，配合试剂盒中的通用反向引物，即可对样本中的miRNA进行检测。
Q: 后续做荧光定量，必须搭配11171ES吗？可以用普通的荧光定量试剂吗？
A: 市面上常见的普通荧光定量大多只能满足80-300bp的片段，短片段的扩增不了。专门的miRNA 荧光定量试剂可以保证短片段产物的合成。
[1] Huang G, Chen J, Liu J, Zhang X, Duan H, Fang Q. MiR-935/HIF1α Feedback Loop Inhibits the Proliferation and Invasiveness of Glioma. Onco Targets Ther. 2020;13:10817-10828. Published 2020 Oct 23. doi:10.2147/OTT.S244409(IF:4.147)
[2] Li H, Pan R, Lu Q, et al. MicroRNA‑145‑5p inhibits osteosarcoma cell proliferation by targeting E2F transcription factor 3. Int J Mol Med. 2020;45(5):1317-1326. doi:10.3892/ijmm.2020.4504(IF:4.101)
