嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomycesalboniger)发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3´末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

       嘌呤霉素产生菌Streptomycesalboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC)，赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。

       嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。

       本品是无菌的、溶于蒸馏水的嘌呤霉素盐酸盐溶液，浓度为10 mg/mL（10 mg/mL in H₂O），可直接用培养基或其他缓冲溶液稀释使用，适用于细胞培养，常用工作浓度为1~10 µg/mL。

本产品对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有效，特别是对链球菌、肺炎球菌等有强效。常用于细胞培养中的抗生素筛选，快速淘汰未转化或未转染的细胞。

研究应用

1. 细胞培养：用于筛选稳定转染的细胞系，确保细胞中目标基因的表达。
2. 微生物学：用于研究细菌耐药性，筛选耐药菌株。
3. 生物化学：用于研究蛋白质合成和翻译终止机制。

使用说明

1. 建议使用浓度

哺乳动物细胞：1~10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定。推荐浓度，请看表1。

大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125 μg/mL。

【注】：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。

表1 嘌呤霉素盐酸盐的推荐浓度

1. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例）

嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线(kill curve)。

1）Day 1：24孔板内以5~8×104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔，以确保后续的梯度实验的进行，37℃细胞孵育过夜。

2）Day 2：①准备筛选培养基：含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0~15 μg/mL，至少5个梯度）；②往孵育过夜后的细胞内更换新鲜配制的筛选培养基；之后37℃孵育细胞。

3）Day 4：更换新鲜的筛选培养基，并观察细胞存活率。

4）根据细胞的生长状态，约2-3天更换新鲜的筛选培养基。

5）每日监测细胞，观察存活细胞率，确定抗生素筛选开始4~6天内有效杀死非转染或所有非转导细胞的药物最低浓度。

3. 哺乳动物稳定转染细胞株的筛选

等转染含有pac基因的质粒后，细胞在含有嘌呤霉素的培养基中增殖，以筛选出稳定转染子。

1）细胞转染48 h后，将细胞（原样或稀释）置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养。

【注】：当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用最明显。细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下降。最好进行细胞分盘使其密度不超过25%。

2）每隔2~3天，移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。

3）筛选7天后评估细胞形成的病灶。病灶可能需要额外的一周或者更多时间，这依赖于宿主细胞系和转染筛选效率。

【注】：每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要48 h，有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。

4）转移和放置5~10个抗性克隆到一个35 mm的培养皿中，用选择培养基继续培养7天。此次富集培养是为日后的细胞毒性实验做准备。

-25~-15℃保存，有效期1年。

Q: 60209，T细胞阳性细胞的筛选浓度。还是按照细胞培养的浓度来的吗？

A: 说明书中有推荐的浓度，但是只是一个参考范围，具体还是要测试一下。说明书表格中没有T细胞，但是可以参考常规的浓度范围：1~10 µg/mL。