Rhod-2是一种可见光激发的高亲和力Ca2+指示剂，与其他可见光激发荧光探针如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有长波长，更适用于检测具有较高自荧光现象的细胞和组织内钙离子水平以及检测由光感受器和笼锁钙离子螯合剂光激活导致的钙离子释放。

与紫外光激发的荧光探针相比，如Fura-2和Rhod-2，可见光激发Ca2+探针具有以下特点：1）可被大多数设备的激发器有效激发，包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。2）具有更强的染料吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测 Ca2+变化，从而降低了对活细胞的光毒性。3）Ca2+依赖性荧光强度增强，对Ca2+变化水平检测敏感度更高。4）降低样品自荧光以及光散射的干扰。5）兼容光激活探针以及UV-激发试剂，因此更方便于多参数检测。6）无光谱偏移。7）长波长钙离子探针，能够与GFP和绿色荧光探针兼容。8）特别定位在线粒体，以罗丹明结构为基础的Rhod-2, AM带正电荷，以电位驱动的方式吸收聚集在线粒体，荧光显微镜下观察进入细胞呈现点状染色模式。

室温运输。-20℃避光干燥保存，可保存1年。

Q：荧光探针用什么缓冲液稀释？

A：工作液用最好是使用无血清培养基 HBSS 或是 PBS 等缓冲液进行稀释，稀释后的探针工作液即可直接加入细胞进行检测。

Q: 几种探针的应用区别和各自染色的定位？

A：如果是测定胞质内的钙离子建议选择 Fluo-3或Fluo-4，如果是测定线粒体内较浓钙离子的实验建议采用Rhod-2。

Q：荧光探针装载完多久后观察？

A：为减少各种可能的误差，尽量缩短探针装载后到仪器测定所用的时间(刺激时间除外)。

Q：使用了钙离子孵育后还可以使用抗体进行孵育共检测吗？

A：钙离子探针是要求活细胞检测，因此对于抗体检测应满足活细胞状态以及使用相应的抗体荧光颜色应与所使用的探针颜色有区分度，不然将难以观察。

Q：rhod-2染线粒体的时候为什么要4℃染色？

A：当温度在37℃时探针倾向于聚集在胞质，在4℃下更偏向于在线粒体中。推测在37度左右温态环境下，胞浆酯酶会变得活跃从而在Rhod-AM未能达到线粒体之前脱去结构上的AM基团而发出荧光。在冷态环境下，酶活性变缓，探针基团可以先附着于线粒体上而后才水解。

Q：Rhod-2探针孵育的温度时间以及对于小鼠原代心肌细胞合适的工作浓度是多少？

A：Rhod-2的孵育温度推荐37℃，室温亦可，4℃为非必须温度；时间参考15~60min，预实验可参考30min；对于小鼠原代心肌细胞根据已使用该探针的客户反馈，2.5uM的工作浓度最适，1uM及5uM均可检测到阳性信号，1uM信号较弱，5uM出现有明显的背景。