Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit 是基于Hieff Clone® 快速克隆技术的定点突变系统。使用本试剂盒，可一次性向目标质粒上三至五个不连续位点（相距超过50bp）同时引入定点突变。该试剂盒由两个模块组成：Hieff® II Pfu DNA Polymerase扩增模块和Hieff Clone® 快速克隆模块。Hieff® II Pfu DNA Polymerase超高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性，其卓越的长片段扩增能力，广泛适用于长度小于20 kb的任何质粒扩增。Hieff Clone®快速克隆系统利用高效的同源重组反应替代传统的退火成环反应。因此使用Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit进行DNA定点突变时，引物设计更加灵活，且扩增反应以指数方式进行，极大减少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的彻底降解。

Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit中的重组酶Exnase MultiS经过优化，专门针对多碱基进行定点突变。此外，如扩增产物特异，其DpnI消化产物可不进行DNA纯化而直接用于重组反应。高度优化的反应缓冲液、快捷的操作流程以及极高的成功率，使得Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit成为DNA多点突变试剂盒。

• 专门针对多碱基进行定点突变

• 不连续多碱基（相距超过50bp）定点突变实验流程（以不连续三碱基为例）

^{冰袋（wet ice）运输。产品-20℃保存。有效期1年。}

Q:多点突变试剂盒与定点突变试剂盒有什么区别？

A:多点突变试剂盒可一步实现目标质粒上 3-5 个不连续位点的定点突变，而定点突变试剂盒是

适合 1 或 2 个不连续位点的定点突变。

如：3 个连续的碱基突变算 1 个位点的突变，故定点突

变试剂盒即可（相距超过 50 bp 为 1 个不连续位点）。

Q:点突变为什么要选择甲基化的载体？

A:点突变过程需要去除模板质粒，防止假阳性。利用的原理就是限制性内切酶DpnI 能消化甲基化的模板，若是非甲基化，则无法去除模板。

Q:对于 PCR 模板质粒什么要求？

A:a）PCR 模板应为甲基化质粒，应使用甲基化酶无缺陷型的宿主菌扩增原始质粒（如DH5α， TOP10，JM109 等）。

b）应尽量使用新鲜制备的质粒作为模板，因长期放置，反复冻融可能会导致模板质粒断裂， 开环或降解。

Q:质粒反向扩增时引物如何设计？

A:正反向扩增引物 5’端包含至少 20 bp 反向互补区域，各引物非互补区域长度至少为 20 bp。互补区尽量选择无重复序列，GC 含量尽量在 40%-60%范围内。