太阳成集团慢病毒包装试剂盒（Lentiviral Packaging Kit）由优化的慢病毒包装辅助质粒混合物（Lentiviral Mix）、表达eGFP蛋白的对照质粒和高效转染试剂（HG Transgene^TM Reagent）组成，可以兼容第二代和第三代的慢病毒包装质粒，且具有慢病毒包装时间周期短（一周之内即可拿到纯化好的高滴度慢病毒）、病毒滴度高的优势，可应用于针对不同基因和药物靶标的临床前细胞学实验和整体动物实验。非常适合于病毒包装初试者。

产品组分

慢病毒包装所需其他材料（选用）

1）DMEM：Yeasen

2）FBS：Yeasen

3）Penicillin-Stretomycin：Yeasen

4）HEK 293T/293FT：慢病毒包装及低度检测所用工具细胞（HEK293T）

5）Antibiotics：Yeasen 用于稳定转染细胞株筛选，如Puromycin，G418等

6）Competent cells：Yeasen

病毒包装前的准备

慢病毒表达载体：包含病毒包装，侵染和将病毒重组基因整合到基因组DNA中以便表达目的基因或者shRNA的基本元件。

DNA溶液的制备：以质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中各种质粒DNA，质粒DNA溶于无菌的TE或ddH₂O中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA 的A260/A280在1.8～2.0之间。

细胞状态：良好的细胞状态对病毒的包装至关重要，避免细胞培养基有细菌、真菌或支原体的污染，尽量使用传代次数较少的细胞，如果细胞是刚复苏的话，最好传两代之后再包装。

慢病毒包装

tyc234cc 太阳成集团慢病毒载体表达系统由pGMLV慢病毒载体和Lentiviral Mix质粒组成。pGMLV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WPRE和cPPT/CTS等。太阳成集团可以根据不同的实验目的针对pGMLV载体改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、RNA干扰等研究。Lentiviral Mix能够表达病毒包装需要的各种必需成分如：gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子；还含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白，可以兼容第二代和第三代的慢病毒包装质粒。

使用流程

制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其辅助包装原件载体质粒，重组质粒载体和辅助质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，使用HG Transgene^TM Reagent进行共转染293T细胞，转染后18 h 更换为完全培养基，培养48 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定病毒滴度。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。

1）293T细胞分盘：转染前一天，将已经长好的细胞以合适比例传代到10 cm培养皿中，当细胞长到~80%时准备转染。

2）转染前换液：转染前1~2 h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基，12 mL/10 cm皿。注意：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞。

3）转染：取无菌的1.5 mL EP管或15 mL离心管，按下列组分配制反应体系：

混匀后，室温放置18 min~20 min后，均匀滴加到提前换过液的培养皿中，后置于CO₂培养箱中培养。

4）换液：转染18~20 h后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中（注意：此时培养基中已含有少量的病毒，必须经处理后才能丢弃，所用的移液枪头等必须经消毒液浸泡处理后才能丢弃），然后加15 mL新鲜的培养基（也可根据实验要求换为无血清的DMEM）继续培养。

5）病毒收集：换液48 h后，吸取细胞上清液于50 mL离心管，4℃，500 g离心5 min，上清液用0.45 μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时上清液中的病毒颗粒可以直接去检测滴度或者感染目的细胞，如果对病毒的滴度及纯度有较高要求，可对上清液进行浓缩与纯化。

6）病毒分装与保存：将病毒以40~50 μL分装，后保存于-80℃。

冰袋运输。HG Transgene^TM Reagent（41102-B）2~8 ℃保存，其余组分（41102-A、41102-C）均于-25~-15℃保存，有效期1年半。

Q:慢病毒包装试剂盒中是否含有 pGMLV 慢病毒载体？稳转怎么筛选？还需要再额外购买其他质粒吗？

A: 含有该载体；稳转筛选所用为Puromycin，G418；后期分选为荧光筛选；只需要客户另外准备目的质粒。

Q: 慢病毒包装试剂盒中 pGMLV 慢病毒载体，有质粒（阳性对照）序列吗？

A: 慢病毒包装，一般用三质粒或者四质粒系统，分别构建病毒的不同组件，我们的慢病毒包装试剂盒，提供阳性对照的质粒，但是：①质粒序列都不提供； ②质粒的酶切位点不能提供。

Q：为什么容易个试剂盒包装的病毒感染成功了，有的却感染不成功？

A：①质粒构建有问题，如果不是同一个质粒，可以质粒测序确定质粒是否正确，是否有移码或者脱靶问题；

②如果质粒没问题，可能是慢病毒载体不正确导致病毒包装不成功，我们试剂盒是兼容二代，三代的慢病毒载体；

③如果以上两种都没问题，可能是感染的细胞是悬浮细胞或者是贴壁不牢的细胞，可以使用聚凝胺增加病毒感染率或者是使用腺病毒包装。

Q:转染试剂放-20了，还可以再用吗？

A：不建议用了，转染试剂是脂质体的，不能冰冻。

Q: 慢病毒包装试剂盒中阳性对照：eGFP 对照质粒（Amp+）的推荐引物序列是什么？

A: GFP-qF:TGTTCACCGAGTACCCCCAG

GFP-qR:CGCCGTAGAACTTGGACTCG。

Q: 包病毒过程中是否可以添加双抗？

A: 不建议添加双抗，会影响病毒包装效果。