Anti-Flag亲和纯化凝胶 ——IP/蛋白纯化好帮手
在生物医学研究领域，蛋白纯化是探索生命奥秘的关键技术。然而，传统的纯化方法往往使普通的蛋白纯化面临着低效率、高成本的困境，对于结构复杂但功能多样的膜蛋白（蛋白结构学的重点研究对象，在细胞膜中低丰度表达且对环境敏感），传统的纯化方法更是使纯化过程困难重重。
如今，tyc234cc 太阳成集团凭借其卓越的研发实力，推出了全新升级的Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白或膜蛋白）（Cat#20585ES，由高质量的鼠源IgG2b单克隆抗体（克隆号：3F5）与4%高度交联的琼脂糖凝胶通过共价偶联制备），可用于带有Flag标签的融合蛋白（分泌蛋白或膜蛋白）纯化和免疫沉淀（IP）。
此外，太阳成集团还提供Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白）（Cat#20584ES，抗体克隆号：1A3）, 尤其适用于带有Flag标签的分泌蛋白的纯化。
高特异性：选用高质量的鼠源IgG2b单克隆抗体，能够特异性吸附Flag蛋白序列。
高 载 量：载量≥1.1 mg蛋白/mL凝胶。
高 纯 度：杂蛋白非特异结合少，得到高纯度的Flag标签蛋白。
用途广泛：可用于蛋白质纯化或IP。
结合蛋白类型多：可结合Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-Flag–Protein），N端Flag融合蛋白（Flag–Protein），C端Flag融合蛋白（Protein-Flag）
1）太阳成集团Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白）（Cat#20584ES）纯化原核表达的N端Flag融合蛋白（Flag-N），Met修饰的N端Flag融合蛋白（Flag-M），C端Flag融合蛋白（Flag-C）。
图1： Yeasen Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白）纯化结果跑胶图
结果显示：Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白）（Cat#20584ES）特异性高，并能结合多种位置的Flag标签。
2）太阳成集团Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白）（Cat#20584ES）与国外进口品牌S*纯化对比测试。
图2 ：Yeasen（a) PK进口品牌S*(b) Anti-Flag凝胶对比测试跑胶图
图3：Yeasen（a) PK进口品牌S*(b) Anti-Flag凝胶每mL凝胶纯化蛋白得率对比测试结果
结果显示：太阳成集团Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白）的载量和目的蛋白得率均明显高于竞品。
3）太阳成集团Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白或膜蛋白）（Cat#20585ES) 纯化低表达的N端Flag融合蛋白（Flag-N），Met修饰的N端Flag融合蛋白（Flag-M），C端Flag融合蛋白（Flag-C）。
图4.Yeasen Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白或膜蛋白）纯化低表达量蛋白结果跑胶图
结果显示：Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白或膜蛋白）（Cat#20585ES) 特异性高，在目的蛋白表达量极低的条件下，也能结合多种位置的Flag标签。
4）太阳成集团Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白或膜蛋白）（Cat#20585ES) 与国外进口品牌S*、品牌G*纯化对比测试。
图5：Yeasen（a) PK进口品牌S*(b)、品牌G*(c)Anti-Flag凝胶纯化低表达量蛋白结果对比测试跑胶图
结果显示：在目的蛋白表达量极低的条件下（比如膜蛋白）， Yeasen Anti-Flag亲和纯化凝胶（分泌蛋白或膜蛋白）（Cat#20585ES)得到的目的蛋白得率、纯度明显优于竞品，且使用Yeasen搭配赠送的1×Flag多肽(Cat#20572ES)洗脱效果更佳。
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问题 |
可能原因 |
推荐解决方案 |
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柱子反压过高 |
填料被堵塞 |
清洗树脂。 |
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裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上样前最好用0.22µm或0.45µm滤膜过滤，或离心去除。 |
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样品太黏稠 |
样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNaseI （终浓度为5µg/ml），Mg2+(终浓度1mM)，冰上孵育10-15min |
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缓冲液太黏稠 |
有机试剂或蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。 |
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洗脱组分中无目的蛋白 |
Flag标签蛋白变性了 |
过度的裂解使目的蛋白变性使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准。 |
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洗脱方式不合适 |
建议更换洗脱方式，优先选择1×flag多肽竞争洗脱。 |
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目的蛋白聚集产生沉淀 |
在细胞裂解前溶液中加入DTT，终浓度为1-10mM |
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融合蛋白改变了Flag的构象，影响了目的蛋白的结合力 |
测定pGEX中Flag的结合力，对载体进行超声处理，检测其结合力。如果载体中Flag有很高的亲和力，有可能是改变融合蛋白的构象从而降低了Flag标签蛋白的亲和力。 |
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降低结合温度至4℃，充分清洗。 |
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目的蛋白没有完全洗脱下来 |
洗脱体积太少 |
增加洗脱液体积，减小洗脱流速。 |
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洗脱液中Gly-HCl的pH 发生改变 |
使用新鲜配制的洗脱液 |
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洗脱液孵育时间不够 |
增加洗脱液与凝胶的孵育时间 |
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电泳或western blot检测中发现多条带 |
Flag融合蛋白已经发生降解 |
在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如加入1 mM PMSF |
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可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的，可使用蛋白酶缺陷型宿主菌（如lon-或ompT） |
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细胞破碎过度 |
减少细胞破碎时间，超声前加入溶菌酶（菌液体积的0.1倍10mg/ml溶菌酶，25mM Tris-HCl，pH8.0），避免发泡导致蛋白酶变性，过度超声破碎增加宿主内源蛋白与Flag融合目的蛋白的共纯化。 |
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抗体与E. coli的各种蛋白反应 |
抗体吸附E. coli蛋白：Flag-抗体；超声处理去除Flag抗体，可以用Western Blot检测 |
重组肠激酶（Cat#20395ES）：特定的蛋白酶，切割前面含有四个天冬氨酸的赖氨酸羧基端位点：Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，DDDDK是八肽Flag标签(DYKDDDDK)的一部分。重组肠激酶（rEK）的使用可以轻松去除融合蛋白的Flag标签，是研究天然蛋白质结构和功能的理想工具。
Anti-Flag纯化磁珠（Cat#20785ES）：一种聚合物磁性微球，由高质量的鼠源抗DYKDDDDK（Flag）单克隆抗体与平均粒径约为70 μm的琼脂糖磁珠通过共价偶联制备，可通过磁性分离直接从生物样品中一步纯化出高纯度的Flag融合蛋白。
Anti-Flag免疫磁珠（Cat#20565ES）：一种聚合物磁性微球，由高质量的鼠源抗DYKDDDDK (Flag) 单克隆抗体与粒径为200 nm的硅基磁珠通过共价偶联制备，可用于带有Flag标签的蛋白免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（Co-IP）。同时提供Flag标签蛋白免疫（共）沉淀试剂盒（Cat#20765ES），包含实验所需必要试剂，更方便客户直接使用。
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产品定位 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
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蛋白纯化凝胶 |
Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel (Secretory or Membrane Protein) Anti-Flag亲和纯化凝胶(分泌蛋白或膜蛋白） |
1 mL/5 mL/ 25 mL/100 mL |
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Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel (Secretory Protein) Anti-Flag亲和纯化凝胶(分泌蛋白） |
1 mL/5 mL/ 25 mL/100 mL |
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洗脱多肽 |
Flag-tag Peptide(Flag-tag多肽) |
5 mg |
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标签切割 |
Recombinant Bovine Enterokinase, His, Expressed in Yeast 酵母表达重组牛肠激酶(His标签) |
100 U/500 U/ 5000 U |
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蛋白纯化磁珠 |
Anti-DYKDDDDK（Flag）MagAgarose Beads Anti-Flag纯化磁珠 |
1 mL/5 mL |
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免疫磁珠 |
Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads Anti-Flag免疫磁珠 |
500 μL/1 mL/ 5 mL |
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免疫沉淀 试剂盒 |
Anti-DYKDDDDK（Flag）IP/Co-IP Kit Flag标签蛋白免疫(共)沉淀试剂盒 |
40T |
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产品名称 |
货号 |
规格 |
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Anti-HA Affinity Gel（Anti-HA亲和纯化凝胶） |
1 mL/5 mL/ 25 mL/100 mL |
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Anti-Myc Affinity Gel（Anti-Myc标签亲和纯化凝胶） |
1 mL/5 mL/ 25 mL/100 mL |
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Anti-HA MagBeads（Anti-HA免疫磁珠） |
1 mL/5 mL |
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Anti-Myc MagBeads（Anti-Myc免疫磁珠） |
1 mL/5 mL |
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Anti-HA MagAgarose Beads (Anti-HA纯化磁珠） |
1 mL/5 mL |
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Anti-Myc MagAgarose Beads (Anti-Myc纯化磁珠) |
1 mL/5 mL |
