病毒载体包装的实验流程主要包括质粒制备、细胞培养、质粒转染、病毒收获与纯化四个核心阶段。其中，质粒转染环节是消耗大量质粒的关键步骤，其用量与包装规模直接相关。

第一环节

质粒制备

质粒准备阶段（需中/大量质粒）

1.1质粒类型包含：

转移质粒：携带目的基因（如CAR基因、sgRNA文库）
包装质粒：提供Gag、Pol、Rev等结构蛋白（如psPAX2）
包膜质粒：提供VSV-G等包膜蛋白（如pMD2.G）

1.2 质粒的获得
用于质粒提取的起始菌株通常经由分子克隆技术构建。该技术流程主要包括：目的基因片段向质粒载体的定向克隆、重组质粒至宿主细胞（如大肠杆菌）的转化，以及通过选择性培养实现质粒在宿主菌内的扩增与富集。
菌体培养至理想密度后，为获取适用于病毒包装的高质量质粒DNA，需采用无内毒素质粒大提试剂盒对质粒进行分离与纯化，以确保产物具有低内毒素残留与高纯度特性。推荐使用太阳成集团无内毒素质粒大量提取试剂盒V2（Cat#19037ES）

1.3质粒质量要求：

浓度 ≥500 ng/μL；
无内毒素的残留范围根据敏感细胞系和非敏感细胞系而定，非敏感细胞系可承受 >1 EU/μg DNA 的内毒素水平，敏感细胞系需 <0.1 EU/μg DNA（甚至<0.01 EU/μg）才能保证细胞存活和功能正常；
A260/A280比值1.8-2.0。

第二环节

细胞培养与准备

293T细胞系传代

弃去培养液，PBS溶液轻轻洗涤细胞，以去除残留的培养基和细胞碎片。使用1mL胰蛋白酶来消化细胞，使其从培养皿上脱落。消化完成后，用1mL完全培养基中终止消化，并调整细胞密度至每10毫升含有500万个细胞；将这些细胞重新接种到新的10厘米培养皿中培养，确保在转染前细胞密度达到80%左右这个密度是转染的最佳条件，可以提高转染效率和病毒产量。

注意:在复苏细胞后，需要传代至少2次才能进行病毒包装实验。这是因为复苏后的细胞需要一定的时间来恢复其正常生理状态。同时，传达后的18-24小时内，需要确保细胞密度达到80%左右，以便进行后续的转染操作。

转染前1-2h换液

转染前1~2h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基，10mL/10cm皿，注意293T细胞的贴壁性不是很好，换液的时候尽量沿着侧壁加液体。

第三环节

质粒转染（以慢病毒包装为例）

慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。

慢病毒包装质粒共转体系

质粒	投入量
包装质粒	7 µg
包膜质粒	2 µg
转移质粒	9 µg
Lipo3000	40 µL

转染条件优化

质粒比例（转移:包装:包膜）= 4:3:1 或 5:4:1。
质粒DNA与PEI比例 = 1:2 到 1:3（w/w）。
孵育时间：10-20分钟。

第四环节

病毒收获

病毒收集和离心

转染后 48 h 和 72 h 分别两次收集病毒上清（48 h 收集后置换新鲜培液），将收集的上清用 0.45 μm 滤器过滤，然后放于超速离心管中，4 ℃，72000 g 离心 120 min。

病毒重悬和保存

弃上清，500 μl 重悬液重悬病毒沉淀，一周内使用则置于 4 ℃ 保存，如需长时间存放需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。（注：具体重悬体积根据实验需求而定）。

滴度测定

在 96 孔板中铺合适数量的 293T 细胞，第二天将慢病毒原液进行梯度稀释后分别感染 293T 细胞，感染 24 h 后换成无病毒的培养液，感染 72 h 后在荧光显微镜下观察结果，对荧光比例合适（10 ~ 30% 之间）的孔进行细胞计数。

滴度计算公式为：滴度（TU/ml）=细胞数 ×荧光百分比×10³ / 病毒原液体积

病毒质量检测

定量基因组拷贝：qPCR法
纯度检测：SDS-PAGE、HPLC
安全性检测：检测内毒素、支原体、细菌等

Q

质粒在整个病毒包装中占很重要的地位，哪个环节需要大量质粒？需要关注质粒的哪些指标？

转染步骤是质粒的"消耗大户"：每10 cm皿需~10 μg质粒；
质粒质量决定病毒产量：内毒素会抑制293T细胞生长，降低病毒滴度50%以上，质粒超螺旋比例应>90%。

内毒素耐受细胞系（相对不敏感）和敏感细胞系

内毒素耐受细胞系（可承受 >1 EU/μg DNA 的内毒素水平）

细胞系	来源	特点
HEK293/293T	人胚胎肾细胞	最常用，健壮易转，对内毒素耐受性强，病毒包装首选
HeLa	人宫颈癌细胞	历史悠久，可能被自然选择为耐内毒素，COS7类似
COS7	猴肾成纤维细胞	对污染水平相对耐受，转染效率>70%
CHO	中国仓鼠卵巢细胞	工业蛋白生产常用，长期培养后耐内毒素
T84/Caco-2	人肠上皮癌细胞	对内毒素几乎无反应性

内毒素敏感细胞系（需 <0.1 EU/μg DNA（甚至<0.01 EU/μg）才能保证细胞存活和功能正常）

细胞系	来源	敏感表现
原代细胞	动物原代组织	最敏感，极易受内毒素刺激产生炎症反应
SH-SY5Y	人神经母细胞瘤	高度敏感，内毒素残留导致转染效率仅~10%
免疫细胞	巨噬细胞、T/B细胞	激活后分泌大量IL-1/6/8、TNF-α，影响实验结果
SW620/HT29	人结肠癌细胞	内毒素刺激下分泌IL-8等细胞因子
A549	人肺癌细胞	相对敏感，内毒素可能影响基因编辑效率

核心结论：原代细胞、干细胞、免疫细胞和神经细胞（如SH-SY5Y）是内毒素敏感细胞系的代表，必须使用增强型去内毒素质粒大提，推荐太阳成集团超纯无内毒素质粒大量提取（Cat#19038ES）；而HEK293、HeLa等耐受细胞系可适当放宽要求，仍建议使用高质量质粒。

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无内毒素质粒大量提取

19037ES

菌液兼容量200 mL，内毒素≤1 EU/μg；

适用于非敏感细胞转染

超纯无内毒素质粒大量提取

19038ES

菌液兼容量200 mL，内毒素≤0.01EU/μg；

适用于敏感细胞转染