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40192ES	基质胶 Ceturegel® Matrix,Phenol Red-Free,LDEV-Free Plus(同康宁matrigel胶)

1. 样本制备

获取卵巢癌手术标本，于无菌条件下操作。使用生理盐水冲洗标本表面。截取约1*1*1 cm的组织块，用镊子小心去除肉眼可见的坏死组织和主要血管后，放入4℃预冷的含1%双抗的DPBS溶液中。

2. 样本清洗

使用含1%三抗的生理盐水，借助注射器轻柔冲洗标本2-3次。

3. 样本处理

将清洗后的卵巢肿瘤组织置于无菌培养皿中，使用手术剪将其剪碎至约1 mm³大小的块状体，随后转移至新的50 mL离心管中。加入预冷的DPBS，轻柔清洗组织块3-5次。

4. 样本消化

向清洗后的组织碎片中加入10-15 mL含有3-5 mM EDTA的预冷DPBS消化液。置于4℃环境中孵育约30分钟，期间每隔10分钟轻轻摇动离心管一次。

5. 洗涤

消化完成后，小心弃去含有EDTA的上清液。加入新的预冷DPBS缓冲液，轻柔漂洗组织沉淀2-3次，以彻底去除残留的EDTA。

6. 收集细胞悬液

向洗涤后的卵巢肿瘤组织碎片中加入10-15 mL预冷的含0.1% BSA的DPBS溶液，使用移液器反复吹打、重悬，使隐窝样结构与基质分离。取少许悬液在显微镜下观察，当发现足够的隐窝样结构后，停止吹打。将全部组织悬液通过70 μm细胞滤网过滤，收集穿过滤网的细胞悬液。

7. 洗涤

将收集的细胞悬液在1500 rpm、4℃条件下离心3分钟，弃上清。重复步骤5（DPBS洗涤）和步骤6（吹打过滤）两次，最后将收集的悬液以相同条件离心，获得较纯净的隐窝样结构沉淀。

8. 混合物形成

用预冷的Ceturegel®基质胶重悬步骤7获得的组织沉淀。调整重悬浓度，使每10 μL基质胶悬液中约含200-600个隐窝样结构。重悬后的混合液需始终置于冰上，并尽快进行后续操作。

9. 铺板

将基质胶与组织的混合悬液种植于24孔板各孔底部正中央，每孔接种30-50 μL，注意避免悬液接触孔板侧壁。将培养板置于37℃、5% CO₂恒温培养箱中，静置孵育约30分钟，使基质胶完全凝固。

10. 培养

待基质胶完全凝固后，沿孔壁缓慢加入已配制好的卵巢癌专用类器官生长培养基，每孔加入800 μL，确保胶滴被培养基完全浸没。将培养板置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。每隔3天更换一次新鲜培养基，并定期在显微镜下观察类器官的生长状态与形态。通常，卵巢癌类器官在培养5-7天内可形成。


图1：Day1培养情况	图2：Day4培养情况	图3：Day7培养情况	图4：Day8培养情况

（数据来源：中山大学附属第一医院）

类器官构建实验小贴士

1.样本处理：无菌操作，快速剔除坏死组织，保持样本低温，确保起始细胞活性。

2.消化过程：严格控制消化液浓度、温度与时间，通过镜检及时终止，避免过度消化。

3.基质胶操作：全程冰上操作，快速重悬与铺板，防止胶体凝固，确保点胶位置居中。

4.培养维持：使用新鲜培养基，定期轻柔换液，保持培养环境稳定，勤于镜检观察形态。

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