如火如荼的单细胞技术目前被大家广为接受，而且单细胞技术除了在科研研究领域遍地开花，也广泛应用于抗体发现、药物评价、用药靶向指导等领域。

现阶段，单细胞测序方法普遍需要依赖于微孔板装置、微流体装置或流体处理。而且微流控、微孔板等装置价格不菲，成为单细胞技术研究的一大壁垒。

2023年3月6日，Nature Biotechnology上发表了一篇关于PIP-seq（Particle-templated instant partition sequencing ）的文章——Clark IC, Fontanez KM, Meltzer RH, et al. Microfluidics-free single-cell genomics with templated emulsification. Nat Biotechnol. 2023;41(11):1557-1566. doi:10.1038/s41587-023-01685-z。PIP-seq是一种不需要专门的微流体设备、专业知识或硬件的方法。它基于粒子模板乳化，允许人们仅使用涡旋器在均匀的液滴乳液中对 cDNA 进行单细胞封装和条形码。粒子模板即时分区测序 (PIP-seq) 适用于多种乳化形式，包括微孔板和大容量锥形管，可在几分钟内处理数千个样品或数百万个细胞。

PIP-seq单细胞实验流程图

图.PIP-seq单细胞实验流程图

a、乳化过程示意图。条形码颗粒模板，细胞和裂解试剂与油和涡流相结合，以产生单分散的液滴。

b、细胞裂解释放mRNA，mRNA与偶联了条形码以及oligod(T)的beads结合。

c、除油后将mRNA逆转录成cDNA。利用TSO进行后续的链置换步骤。

d、全长cDNA获取，cDNA含有条形码以及Illumina测序所需序列。

让我们来看看作者发表的文献中PIP-seq的数据表现情况吧。

01

PIP-seq的双胞率表现

使用人和鼠的混合样本进行PIP-seq实验，总细胞捕获数为1595个，其中双胞细胞数为12个，双胞率为0.75%

双胞率检测结果图

图.双胞率检测结果图

02

单细胞分群情况

使用健康的乳腺样本同时用PIP-seq和10x Genomics V3版本试剂进行实验，结果显示PIP-seq能区分管腔上皮细胞(LEP1和LEP2)、肌上皮细胞、成纤维细胞、血管细胞和免疫细胞的两个谱系。将10x的数据进行数据抽取，使其捕获细胞数降至2400个，每个细胞的测序量维持在36500reads。最终对比显示，PIP VS 10x Genomics结果为，unique gene数为2298 vs 1757，转录本数对比7491 vs 3394，线粒体占比2.34% vs 1.32%。PIP-seq与10x Genomics结果进行marker基因分析，结果显示marker基因分析结果一致。

图：使用PIP-seq精确地分析健康乳腺组织的单细胞转录谱（PIP-seq及10x Genomics结果对比）

03

PIP-seq的其他应用

PIP-seq用于CRISPR筛选

使用PIP-seq进行CROP-seq实验，结果显示PIP-seq能够用于CRISPR筛选。

图.使用PIP-seq进行转录组和gRNA测序

MPAL复发的转录组学特征

图.细胞系和人类样本中耐药癌症表型的分子特征

结论

该文章作者证明PIP-seq在小鼠-人混合研究中产生高纯度的转录组，与多组学测量相兼容，与商业微流体平台相比，可以准确表征人类乳腺组织中的细胞类型。使用PIP-seq对混合表型急性白血病的单细胞转录谱分析揭示了标准免疫表型所隐藏的化疗耐药细胞亚群内异质性的出现。PIP-seq是一种简单，灵活和可扩展的下一代工作流程，可将单细胞测序扩展到新的应用。

对于能不使用特定设备就能完成的单细胞实验，肯定是会广受好评，但是PIP-seq仍然需要有更多的应用才能被市场接受。那有没有其他技术是广被市场认可的呢？Smart-seq2当仁不让可称之为被市场认可的无需特定昂贵设备就能完成的单细胞实验（ps：前期需要通过单细胞分选）。Smart-seq2能得到单细胞全长转录组序列，单个细胞的基因检出数是目前单细胞技术中最高的（可参考Smart-seq2：单个细胞以及微量细胞转录组建库成功的保障）。

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