背景介绍

慢病毒（Lentivirus, LV）是逆转录病毒科下的一个属，是一种有包膜的RNA病毒，直径约80-120nm，呈二十面体对称结构、球形。它的病毒颗粒最外层是包膜（包膜蛋白决定了感染细胞的类型），再往里依次为基质蛋白和衣壳，最里面是两条相同的正股RNA链和酶。

通常，对慢病毒的利用，更多的是通过慢病毒载体来进行的。慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主的染色体上，从而达到外源基因的持久性表达，是体外和体内基因传递的有效工具。此外，与其他的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体可以将转基因技术整合到分裂和非分裂细胞的基因组中。

慢病毒感染宿主细胞，需要先进行病毒包装。慢病毒包装系统一般由慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒混合物（Mix）共两部分组成：慢病毒表达载体（即穿梭载体）含包装、转染、稳定整合所需要的全部遗传信息，是慢病毒包装系统的主要组成部分；慢病毒包装质粒混合物（Mix）含一个包装元件质粒，表达gag/pol以及各种辅助蛋白，还含有一个包膜蛋白质粒，表达VSV-G包膜糖蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到包装所用的细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

慢病毒感染体系完整保留了原本逆转录病毒高表达效率和长表达时间的优点，并且在感染能力上有了巨大的提升。慢病毒载体是目前产业应用最成熟的病毒载体类型，尤其是在免疫细胞治疗，如CAR-T疗法中起到了关键性的作用。且从目前为止的表现上看，CAR-T发生的部分安全性问题都与慢病毒的使用无关。

慢病毒滴度检测及法规监管要求

在慢病毒载体制备的工艺开发过程中，需关注病毒载体质量标准的建立，包括病毒滴度、宿主细胞残留DNA、宿主细胞残留蛋白、支原体等检测指标。测量病毒滴度对于病毒使用以及进行感染细胞是至关重要的，也是慢病毒载体生产的关键质量属性(CQA)。

针对病毒滴度的检测，我国的监管机构近年来也发布了相关的指导原则，具体为：

2018年6月，中国食品药品检定研究院发布了《CAR-T细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》，指出：除病毒转导滴度外，还可通过检测病毒载体特定抗原或病毒基因拷贝数来检测病毒载体的物理滴度，如慢病毒载体p24抗原含量的检测。
2020年版《中国药典》三部的人用基因治疗制品总论中对于含量有提到：在制品为病毒载体的情况下，还应进行总颗粒数或基因组拷贝数等物理数量与感染性滴度比例的测定和控制。

滴度检测包括物理滴度（病毒载体总颗粒数）和转导滴度（病毒载体感染性颗粒数）。

物理滴度：载体特定蛋白/核酸的定量可用于载体颗粒数量（物理滴度）的估计。也即总颗粒数和基因组滴度表示病毒的物理数量，为物理滴度。例如，HIV-1衍生的慢病毒载体，可通过ELISA方法检测病毒载体样本中的p24蛋白从而进行物理滴度的检测，也可以通过qPCR的方法检测载体基因组RNA拷贝数而实现物理滴度的检测。
转导滴度：可使用基于细胞的体外检测方法检测病毒载体的感染能力。通常待测病毒载体感染细胞一定时间后，通过细胞基因组定量PCR、流式细胞术、组织/细胞病变或形成噬斑等方法检测，计算出病毒载体的转导滴度，检测结果通常以转导单位（TU/ml）、半数组织培养感染剂量（TCID50）或噬斑形成单位（PFU）等表示。

由于转导滴度涉及到将选定的病毒载体感染到靶细胞中，而处于不同的研发和生产目的等，各企业使用的靶细胞各不相同，需要针对每个项目具体分析。因此，本文主要针对通用性和普适性较强的病毒物理滴度检测进行分析。

慢病毒物理滴度的检测方法

2022年5月国家药品监督管理局药品审评中心(CDE)发布《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》中指出：应考虑采用多种方法进行病毒滴度的检测，并积极探寻不同检测方法间检测数值的相关性。其中还提到：常见的病毒物理滴度检测方法包括P24 ELISA法（检测载体样本中的p24蛋白）、qPCR法测慢病毒滴度（定量测定上清液中含基因组的慢病毒颗粒）等常用方法，其他新技术检测病毒颗粒数，如病毒计数仪法、纳米颗粒跟踪分析法、场流分离-多角度激光光散射法等，应关注方法对待测病毒类型的适用性。

分类	检测方法	原理	检测条件和检测时间
活性滴度（转导单位/mL，即TU/mL）	荧光计数法	检测慢病毒载体感染后，靶细胞中目的基因的阳性率	需要使用慢病毒感染靶细胞，检测过程一般需要5~10天
活性滴度（转导单位/mL，即TU/mL）	定量PCR法	检测整合到靶细胞基因组DNA中的慢病毒序列拷贝数	需要使用慢病毒感染靶细胞，检测过程一般需要5~10天
物理滴度（P24 ELISA：pg/mL；qRT-PCR：copies/mL；最终为病毒颗粒数/mL）	P24 ELISA法	检测慢病毒颗粒上的P24蛋白含量	直接检测慢病毒总颗粒数，不区分是否有感染靶细胞的能力，检测时间1~2天
物理滴度（P24 ELISA：pg/mL；qRT-PCR：copies/mL；最终为病毒颗粒数/mL）	qRT-PCR法	检测慢病毒样本中的基因组RNA拷贝数	直接检测慢病毒总颗粒数，不区分是否有感染靶细胞的能力，检测时间1~2天

表1.慢病毒滴度检测方法介绍

目前，行业内对于慢病毒物理滴度的检测，通常采用ELISA检测法和qPCR法结合使用，以提高检测结果的可靠性。为此，tyc234cc 太阳成集团自主研发了HIV-1 p24 ELISA Kit和慢病毒物理滴度qPCR检测试剂盒。

其中，qPCR法的检测试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理，可专一快速的检测慢病毒RNA，线性范围最宽可达5copies/μL~5×10⁸copies/μL，检测限低至0.5 copies/μL。还研发了与之配套使用的宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒，以及配套的自动化核酸提取仪器。

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产品资质

符合法规：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63药典要求验证，符合国际权威机构的标准；
配合审计：产品生产符合ISO13485质量体系标准，有完善的审计文件；
保障品质：试剂盒所需酶原料全自产，且已产业化，供货稳定；
技术经验积累：TaqMan法有技术沉淀，使得Kit灵敏度高；
专注产品性能：Taq酶抗体库，双封闭抗体提高了Kit特异性、稳定性等。

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产品特点

抗干扰性：针对复杂基质，样本加标回收率至少能达到70-130%；
灵敏度高：定量下限(LLOQ)为5copies/uL，检测下限(LLOD)为0.5 copies/μL；
精密度高：批内重复性高CV＜10%，批间差异小即中间精密度CV＜15%；
专属性强：特异性检测慢病毒基因组RNA，不受其他外源基因组RNA等的干扰；
防干扰强：引入内部质控(IC)，可排除样本干扰、反应配制异常等因素，有效避免假阴性。
验证完善：参考ICH Q2（R2）分析方法验证指导原则，可提供完善的验证报告。

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验证内容

慢病毒物理滴度qPCR法检测验证项目		参考标准or要求	备注
1、试剂盒标准品（参考品）		含HIV-1慢病毒载体基因组保守区(LTR)序列的质粒RNA
2、线性范围	标曲范围	参考说明书或实际情况（5×10¹ copies/μL~5×10⁶ copies/μL）
	R2	≥0.98（P.s.本试剂盒≥0.99）	药典要求
	斜率	-3.1~-3.8（P.s.本试剂盒-3.1~-3.6）	药典要求
	扩增效率	90%~110%（P.s.对应的斜率-3.1~-3.6，行业内要求）
3、准确性	回收率	50%~150%（P.s.本试剂盒70~130%）	药典要求
4、精密度	重复性	CV＜10%
4、精密度	中间精密度	CV＜15%
5、专属性		不受其他来源基因组RNA的干扰
6、灵敏度	定量限	5copies/uL
7、耐用性	仪器适用性	Thermo：ABI 7500、ABI QuantStudio5；上海宏石：SLAN-96S.
8、稳定性	加速稳定性	37℃稳定7天
	反复冻融	≥10次
	有效期	-25~-15℃保存1年
9、空白限	无模板对照（NTC）	重复24次qPCR扩增曲线未起峰

产品信息

类别	产品	货号	品名	规格
物理滴度 qRT-PCR法	样本前处理试剂盒	18461ES	MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit 磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒（瓶装）	25T/100T
	样本前处理试剂盒	18467ES	MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN 磁珠法48孔样本前处理试剂盒FN（预封装)	3×16T/ 6×16T
	核酸提取仪器	80511ES	48通道自动化核酸提取仪	48通量
	慢病毒滴度qPCR检测试剂盒	41333ES	Lentivirus Physical Titer qPCR Detection Kit 慢病毒物理滴度qPCR检测试剂盒	50T/100T
物理滴度 P24 ELISA法	P24 ELISA试剂盒	99301ES	HIV-1 p24 ELISA Kit 慢病毒(p24 抗原)检测试剂盒	48T/96T