细胞凋亡（Apoptosis）是一种有序的或者程序性的细胞死亡方式，是细胞受到特定基因调控后的主动性死亡过程，也是正常的细胞生理应答反应，凋亡的细胞最终将被体内吞噬细胞处理。过度的细胞凋亡将直接导致组织器官功能的下降；而对于癌细胞来说，凋亡过程中断则意味着癌症的发展和扩散。

细胞的形态学变化

通常可分为3个阶段。第1阶段是细胞的间接触消失，但是胞膜尚完整，粗面内质网上的核糖体脱落，细胞核出现固缩表现，本阶段持续时间很短；第2阶段是细胞核碎裂后与细胞内的各种细胞器结合，并进一步被质膜包裹形成凋亡小体；第3阶段是吞噬细胞吞噬凋亡小体，并将其消化为重新供机体使用。

细胞凋亡的机制

（1）细胞凋亡的死亡受体途径及调控：死亡因子受体(Fas)/死亡因子Fas配体( FasL)死亡通路；TNFR 死亡通路。

（2）线粒体途径及调控。

（3）内质网通路：CHOP通路；JNK 通路；Caspases 12通路。

（4）端粒酶途径的细胞凋亡。

（5）NO参与的细胞凋亡反应。

常用的细胞凋亡检测方法有以下几种：

①形态学检测

发生凋亡的细胞在形态上有一定的特征，最常用的形态学检测手段是荧光共聚焦激光扫描显微镜和透射电子显微镜，前者可让特异性染料（Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI）染色，可非嵌入式结合A-T碱基区的DNA在受到紫外线激发时会发射明亮的蓝色荧光。

DAPI染色，Hela细胞凋亡时核染色质的形态学变化

同时，凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。电镜下可看到凋亡细胞体积变小，表面微绒毛消失，细胞质浓缩。

电镜下，Jurkat细胞凋亡时核染色质的形态变化

②用的最多的Annexin V /PI双染色法检测早期凋亡

正常细胞膜的磷脂分布是不对称的，活细胞中磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)位于细胞膜的内表面，细胞凋亡时，细胞膜发生变化， PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。Annexin V是一种对PS有高度亲和力的、钙依赖性的磷脂结合蛋白，Annexin V可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS, 而活细胞的PS位于细胞膜的内表面，无法与Annexin V特异性结合。所以可以用FITC偶联的Annexin V鉴别凋亡细胞和活细胞。

坏死细胞的PS也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面，Annexin V也能识别坏死细胞表面的PS, 所以Annexin V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。而PI染料能够与细胞内的DNA结合，区分坏死细胞和活细胞。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合，所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞，而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合，坏死细胞内PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光，被相应通道接收。所以Annexin V和PI同时使用，就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。

③细胞凋亡---线粒体膜电位检测

JC-1是亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。正常生理状态下，线粒体负电性高，JC-1进入线粒体以多聚体存在，红色荧光强，细胞凋亡时，线粒体去极化产生，负电性降低，JC-1则以单体存在细胞质，绿色荧光增强。

④细胞凋亡—活化的Caspase-3检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原（32 KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17 KD）和两个小亚基（12 KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，Caspase-3 的活性明显下降。

活化的Caspase-3由其前体裂解的一个17KD亚单位和一个12KD亚单位组成，形成异二聚体，可被Anti-Active Caspase-3抗体特异性识别。用荧光素标记Anti-Active Caspase-3抗体即可检测到活化的Caspase-3。

⑤细胞凋亡—DNA片段化的检测

细胞凋亡时染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180~200bp及其整数倍的寡核苷酸片段,。DNA一旦发生片段化，在DNA双链结构上会出现很多缺口，可以使用FITC标记的DUTP或BrdU在酶的作用下掺入到缺口中，然后检测掺入的信号强度，来判断发生片段化的程度

⑥Tunel检测法

此外，围绕DNA断裂的检测方法还有Tunel检测法。细胞凋亡时DNA双链或单链断裂会产生大量的粘性3’-OH末端。以此为线索，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）协助下，他成功将生物素/荧光素标记的dUTP绑定在3’-OH末端，并通过酶联显色或荧光检测来定量分析结果。

总之，细胞凋亡就是凋亡通路中的各种分子促成的，不能因为检测单一指标就轻易断定凋亡的发生。毕竟，细胞凋亡事件中，每个指证只维持一段时间，因而各位小伙伴们应该广撒网、多捞鱼，最好能在不同时间段进行多指标的同时检测，这才能确定凋亡的发生。最后为了不造成假阳性和假阴性，阳性＆阴性对照也是必不可少的，以保证检测结果的准确性。

YEASEN细胞凋亡检测系列产品

产品	货号	规格
Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit 细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒	40301ES50/60	50 T/100 T
Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit	40302ES20/50/60	20 T/50T/100T
Annexin V-EGFP/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit	40303ES20/50/60	20 T/50/100T
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit	40304ES20/50/60	20 T/50T/100T
Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit	40305ES20/50/60	20 T/50T/100T
TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC) TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（FITC）	40306ES20/50/60	20 T/50T/100T
TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488) TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Alexa Fluor 488）	40307ES20/50/60	20 T/50T/100T
TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 640) TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Alexa Fluor 640）	40308ES20/50/60	20 T/50T/100T
Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit	40310ES20/50/60	20 T/50T/100T