Q：Control DNA Template 的长度是多少？
A：体外转录后长度：1142bp；质粒模板本身长度~3700bp。
Q：T7 试剂盒有帽子结构和polyA 吗?
A：polyA 尾是设计模板时引入，加帽是单独加。
Q: IVT体系如何优化？
A: ①提高NTP，帽类似物的投入量比例；②添加剂的合理应用；③反应温度可以用到40度。
IVT体系优化可以从模板，T7酶的使用量，如果是共转录加帽可以考虑帽子与NTP之间的比例；酶法加帽的话，在加帽酶，2-O-甲基转移酶以及SAM的用量配比上进行条件优化。关于模板除了线性化要完全这一块，还有一点就是序列设计这一块，例如在5’UTR区注意uAUG以及Kozak序列；CDS需要考虑密码子偏好性，GC3含量，双核苷酸偏好性等；3’UTR：RBP以及miRNA结合位点：还有一个就是RNA的二级结构，5’UTR前序列稳定的二级结构会降低mRNA的表达；3’UTR稳定的二级结构会提高mRNA稳定性，促进mRNA编码蛋白的表达。推荐的IVT体系和更多细节tips，请参考tyc234cc 太阳成集团mRNA体外合成实验手册。
Q: IVT反应20ul体系放大到10ml,产量下降，单位体积产物得率下降约50%；你们是否遇到过这种情况，有何建议？
A: 20uL体系等比放大到10mL应该得率差不多的，我们一般从20uL直接放大到50mL，得率基本也在100ug/20uL的水平；我们50mL也会用离心管和金属浴的方式来测，10mL正常来说应该放大效果更好；这种情况下，一般建议酶和NTP的终浓度微调一下再试试。
Q: 现在大多数mRNA完整性能做到多少？
A: 就我们的其他客户返样，我们用Qsep100测的CE结果来看，比较理想的状况CE完整度能到88~92％；当然做到这个水平通常也需要经过一系列的优化；
一般产量是在120-220ug/ul（产量与序列设计有很大关系），共转录方式，mRNA产量有8g/L，做工艺优化产量会提升，目前市面上的工艺质量参数，有的是观察GFP的荧光值，有的是用lc-MS测量加帽率。
Q: 你们自己测试过程中是否会用琼脂糖电泳来检测mRNA产物？
A：RNA电泳我们也会做，主要是简要的看一下产物纯度，是否有明显的聚体这些；如果是看RNA大小，电泳的时候一般会点一个明确大小的RNA样，作为参考。
Q: 你们会对DNA模板中的Rnase残留进行检测吗？
A: 对模板的检测目前能找到的主要是序列完整性还有内毒素、宿主核酸残留这些检项，RNase还没有明确找到对应的检测建议方法；或者也可以参考我们酶产品中RNase残留的检测方法，相对还是比较简单可靠的。
Q: IVT反应过程中dsRNA的生成机制是什么？
A：IVT过程中的ds生成有多种可能的原因，主要有：
①T7 pol会以产物RNA作为模板，在其3'末端继续延伸RNA，延长序列与原RNA分子3'末端序列互补配对，形成发卡结构；
②T7 pol可以把RNA当作模板来复制RNA分子，合成与其互补的另外一条链；
（除去dsRNA目前是没有很好的方式，有专利报导用纤维柱（sigma）可以试一试）
Q: 控制体外转录阶段产物中dsRNA含量是否有可行的方案？
A：关于优化IVT体系与反应条件抑制dsRNA的建议主要还是以下几点：
①降低镁离子浓度；但降低镁离子浓度也会导致RNA合成产量的降低，需要去一个平衡点；
②提高IVT反应温度，50-56℃的反应温度能有效降低产物中dsRNA的含量；但是高温反应对工艺放大设备的要求会不一样，也可能提高成本；
③IVT反应体系中添加某些离散剂，如尿素、甲酰胺等；这个路线我们的工艺研发团队也做了一些摸索，是可以起到抑制dsRNA的效果的，但是否适合工艺放大还有待进一步研究
Q: IVT的反应过程中出现沉淀的原因是什么，怎么优化？
A: 内部有研究过这个沉淀，是镁离子、RNA、钠离子和焦磷酸镁的聚合物，且有个凝聚作用，聚团会不断变大（类似的胶状、絮状、颗粒沉淀都是类似原理）， 加水和加EDTA的效果类似也佐证了这个说法。原因：1.Mg离子浓度过高会和焦磷酸聚集形成焦磷酸镁沉淀，但是具有聚合作用，不断地包裹核酸形成胶状物导致产量下降。2.RNA产量较高也会析出沉淀。
这种沉淀的产生是偶然性的，与序列设计也有很大关系。
解决办法：（1）减少镁离子的浓度，但会牺牲产量，需要增加T7酶用量以及延长反应时间（从2h，延长到3-4h）;（2）NTP的存在形式（镁离子浓度高，例如46mM是不会挑NTP的，但当镁离子浓度降低，NTP（Tris盐形式）产量无太大变化，三Na形式的NTP产量下降明显。
Q: mRNA生产阶段工艺放大的反应器选择有什么思路？
A：可以考虑WAVE、海道夫反应釜、赛多利斯，主要还是需要找到和现有IVT体系适配的袋子；对于搅拌罐体，螺旋桨的转速也需要根据实际情况优化，跟桨叶类型和大小有关系，建议可以向设备生产厂家咨询。
Q: 你们推荐两步法的还是一步法的？为啥目前很多都还是使用的两步法的？
A: 工业上酶法加帽最常使用的是牛痘病毒加帽酶处理IVT产物可以将其修饰成Cap 0 mRNA，Cap 0结构可以在二氧甲基转移酶（2'O-methyltransferase）的作用下进一步修饰成Cap 1（m7GpppmN）。利用酶法加帽，加帽效率可以达到95%以上。共转录加帽法操作简便，但由于GTP会竞争帽状二聚体，因此该方法加帽率低一些；两种方式各有优缺点。
Q: IVT体外转录产量有多少？
A: 目前我司体系为20ul的反应体系，体外转录的产量为100-200ug，内部的放大体系10ml可达到50mg—100mg。
Q: 体外转录随着反应时间的延长大于2h之后，完整度和产量比较会降低？生成的mRNA如何保证稳定性？
A: 建议整个反应时间在2-3小时之间，我司验证最长3h反应，合作客户有验证4h 反应结果正常。
Q: 是否可以帮忙设计mRNA体外转录DNA模板序列（主要是新冠疫苗应用方向的）？
A: 不提供相关服务。新冠疫苗目前主要可以直接参考的还是外网开源的BioNtech和Moderna的疫苗序列。主要原件序列基本是可靠的，除了polyA尾不全；国内比较早的新冠疫苗，还是基于RBD蛋白序列的比较多。这块我们没有要到具体的序列，基本都是各个研发团队的核心技术了。
Q: 太阳成集团加帽率、加尾检测用的什么方法，什么仪器？
A: 加帽用的是安捷伦系列（6230B TOF），加尾用的Thermo的QE或waters的Rda。
Q: 你们加A尾的方式是采用加尾酶的吗？你们一般建议连接多少个碱基？
A: 我们这个试剂盒没有加poly A尾的组分，可以在模板制备阶段将A尾构建到质粒上，长度一般在20-200。
Q：产品纯化步骤，以最大速度离心是多大的转速呢？
A：13000rcf 以上都可以的。
Q：这个B组分的Buffer为什么会有沉淀出现？如何处理呢？
A：沉淀是亚精胺，正常现象，可以手握溶化。
