Hieff NGS® Ultima Pro DNA Library Prep Kit for Illumina®是针对 Illumina®高通量测序平台专业开发设计的新一代建库试剂盒。本产品采用高质量的酶学组成，在前一代建库试剂盒的基础上，改进了 DNA 片段末端修复和加 A 效率，同时改善接头连接效率。本试剂盒采用了新型的高保真酶，显著提高扩增均一性和保真性，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组、FFPE、cfDNA、ChIP DNA 等样本，助力获得优异的测序数据。
- 适用500pg-500ng所有DNA样本，包含cfDNA、FFPE等。
- 业界领先的文库转化率，最高可达70%以上。
- 多样本验证可获得优异的文库与测序数据。
- 严格的批次性能与稳定性质控。
Ultima Pro DNA 建库试剂盒用于 FFPE 样本建库（未分选）
Ultima Pro DNA 建库试剂盒用于 cfDNA 样本建库
-25~-15℃保存。
Q：机械法建库试剂盒可用于哪些应用？
A：全基因组测序，靶向捕获测序，扩增子测序，ChIP-Seq 等。
Q：机械法建库试剂盒可用于哪些样本？
A：常规动植物基因组 微生物基因组 FFPE cfDNA ChIP DNA 等。
Q：初始DNA 投入量范围是多少？
A：500 pg-1 μg Fragment DNA 样本。12201 适用于 500 pg-500 ng Fragment DNA 样本
Q：12199 12200 12201 建库试剂盒建库接头搭配选择？
A：根据客户需求提供。如完整接头（Cat#12615-12618）：单端 48 index（如客户需求更多 index 可咨询技术）；单端短接头(Cat#12611-12612)：单端 96 index；双端短接头(Cat#12412-12413)： 双端 384 index；UDI 短接头(Cat#12404-12407)：384 双端唯一Index
Q：我们的建库试剂盒里面包含接头吗？
A：我们所有建库试剂盒都是不包含接头的，接头有设置单独的货号，可根据客户选择提供。
Q：12199 12200 12201 扩增模块如何选择？
A：太阳成集团提供两种扩增模块。高扩增效率模块（Cat#12620）注重高效扩增，文库产量高但保真度受影 响；高保真模块（Cat#12621/12624）注重高保真扩增但文库产量受影响，适用于后续 SNP 检测。目前客户如果需要高产量扩增，推荐 12199 Ultima 建库试剂盒；如客户后续做 SNP 检测相关，可推荐12200 MaxUpⅡ DNA/12201 建库试剂盒。
Q：12199 12200 12201 13310 13311 纯化磁珠如何选择？
A：Cat#12601，Hieff NGS DNA Selection Beads 或Cat#A63880，AMPure XP Beads 或其他等效产品。
Q：12199 12200 建库一次需要多少磁珠？
A：
Q:建库试剂盒本身不会造成文库锯齿状，更多应考虑样本和实验过程问题：
A:1）Input DNA 量偏低。根据maxup II 说明书推荐，全基因组测序Input DNA 应大于 50ng，靶向捕获测序Input DNA 应大于 10ng，目前客户的上样量偏低（1ng，10ng 和 50ng），可能造成建库不成功。 2）样本片段化不完全。部分酶法片段化方式，可能造成锯齿状。 3）PCR 扩增循环数过高。根据经验，当 cycle 大于 15 个循环时，可能造成非均一扩增，呈现文库锯齿状。
Q：文库扩增的效率和保真性，怎么从这个图中看扩增效率和保真性？
A：扩增效率即扩增一定产量所用的 PCR 循环数，相同产量PCR 循环数越低则扩增效率越高；保真性即 PCR 扩增时候出现碱基错配的概率，错配率越低则保真性越高。以 CanaceⅡ高保真酶为例，保真性是普通Taq 酶的 52 倍，是 Pfu 的 6 倍。高保真酶扩增的时候必来带来一定的偏好性，会优先扩增中等GC 含量的片段，下图即体现的是高保真酶的偏好性问题。正常情况下，若无 GC 偏好性，也就是说所有的片段经过相同的扩增之后都是一样的。这时候蓝色的圆圈点也就是与纵坐标1.0 直线重合。如果蓝色圆圈在纵坐标 1.0 以上，则可能是出现对于该处 GC 含量的偏好性扩增导致。
Q：不同测序深度Coverage 解读？
A：Coverage 即基因组覆盖度，指的是测序获得的序列占整个基因组的比例。不同测序深度下序列的coverage 肯定也是有差异的。简单来说，10×意思就是说有 10 个测序 reads map 到基因组的某个位置，200×是说有 200 个测序 reads map 到基因组的这个位置。一般情况下测序深度越高，coverage 也会随之降低。
Q：构建得到的文库产量低
A： 1. DNA 质量低，样本中含抑制物（抑制酶活性等） Input DNA 制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或者其他盐，可能会影响末端修复以及 A 尾添加等步骤的反应效率，DNA 在TE 溶液中进行片段化，不要在无菌超纯水中进行。 2.RNA 污染 样本中存在RNA 污染会导致DNA 定量不准确，使文库构建时DNA 上样量不足。 3.PCR free 的时候上样量不足 当使用完整接头且Input DNA 大于 200 ng 时候，不用 PCR 扩增。如果文库拷贝数过低不能进行直 接测序，可在接头连接完成后对DNA 文库进行PCR 扩增。 4.接头出现降解：接头存储不当会出现降解，影响连接效率。一般稀释过的接头可在室温放置 48h。 判断接头是否降解的方法： 用安捷伦 2100 毛细血管电泳检测，通过电泳条带大小判断；如果未发生降解，则条带大小大概为 62bp（complete adapter），如果发生降解，则无条带或条带很小。 用Qubit 酶标仪等检测仪器进行浓度测量，粗略判断接头是否降解。 检测方法：取 1uL，15uM 的complete 接头（12615ES-12618ES）若 Qubit 检测浓度 600ng/ul 左右，则 接头正常，反之若小于 600ng/ul，则接头可能降解成单链或小片段。酶标仪检测同理。
Q：文库电泳的时候条带异常
A：1 出现小片段（60-120bp） 小片段一般为接头片段或接头所形成的二聚体，一般可用 12601 DNA 磁珠进行纯化； 2.文库富集之后出现大片段 一般文库接头在 120 bp 左右，若文库片段增加幅度超过了 120bp 则可能是扩增过度，导致片段扩增异常。此时需减少PCR 循环数 3.接头连接前片段异常片段化时间或者条件选择不当。
