Hifair® Ⅲ One Step RT-qPCR Probe Kit是以RNA为模板进行定量PCR反应的试剂盒。在实验的过程中，逆转录和定量PCR在同一反应管中进行，简化了实验操作，降低了污染的风险。本试剂盒以RNA为模板，使用基因特异性引物，利用耐热Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase高效合成第一链cDNA，并搭配使用探针和UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase，配合优化的缓冲体系能够特异灵敏的对RNA模板进行精确定量。
本试剂盒以预混的Mix形式提供，2×Hifair® Ⅲ P buffer包含优化的缓冲体系和dNTPs等，优化了有效抑制非特异性 PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适用于荧光标记探针的高特异性检测系统。此外，Hifair® UH Ⅲ Enzymes包含比例优化的Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase、RNase inhibitor及UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase等。
产品组分
| 组分编号 | 组分名称 | 11145ES50 (50 T) | 11145ES70 (200 T) |
|---|---|---|---|
| 11145-A | 2×Hifair® Ⅲ P buffer | 500 μL | 2×1 mL |
| 11145-B | Hifair® UH Ⅲ Enzymes | 50 μL | 200 μL |
| 11145-C | Hieff® 50×High Rox | 20 μL | 80 μL |
| 11145-D | Hieff® 50×Low Rox | 20 μL | 80 μL |
| 11145-E | RNase free ddH2O | 500 μL | 2×1 mL |
灵敏度高
冰袋运输。-20℃避光保存，有效期1年。本品避免反复冻融。建议分装保存。
Q：标准曲线扩增效率小于 90%或者大于 110%，线性关系不好，这样的问题如何解决？
A：加样误差。加大模板稀释倍数，提高加样体积，使不同稀释度的加样体积更准确；
标准品降解。重新制备标准品；
模板浓度太高。存在反应抑制，增加模板稀释倍数； 引物扩增特异性不好。重新设计引物。
Q：反应结束无扩增曲线出现
A：反应循环数不够，可适当增加循环次数。一般设置为 40，需注意过多的循环会增加背景信号，降低数据可信度；
确认程序中是否设置了信号采集步骤。三步法扩增程序应该将信号采集设置在 72℃延伸阶段， 两步法一般在退火延伸阶段收集；
确认引物是否降解。长时间未使用的引物应先通过PAGE 电泳检测完整性； 模板浓度太低。减少稀释度重复实验；
模板降解。重新制备模板。
Q：实验重复性差如何解决？
A：加样体积不准。定期校正移液器，将模板高倍稀释，以大体积加入反应体系中； 定量PCR 仪器不同位置温度控制不一致，定期校准仪器；
模板浓度太低。模板浓度越低，重复性越差； 做 4-6 个复孔，删除其中重复性不好的孔。
Q：模板的稀释液如何选择？
A：Nuclease-Free water、DEPC 水或实验室自备的 ddH2O 都可以。不推荐使用 TE 作为稀释液，TE 里有EDTA 会抑制酶的活性。
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