Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit是一款简便、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，可高效克隆50 bp-10 kb片段。将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，仅需50℃反应20 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。

• 阳性率高

• 单片段高效重组

Hieff Clone® One Step Cloning Kit（Cat# 10911）可以有效克隆不同长度的单片段基因。A-D：重组转化平板。E：插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H：插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分别是1.2 kb，3 kb和5 kb，载体与插入片段摩尔比：1:3，重组反应条件：50℃，20 min。

冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。

Q：最佳克隆位点选择？

A：应避免选择克隆位点上下游 50 bp 内有重复序列的区域。并且克隆位点上下游 20 bp区域内 GC 含量尽量在 40%-60%范围内。

Q：载体线性化的方式有哪些？

A：酶切（包括单酶切和双酶切）或反向PCR，建议双酶切。

Q：线性化载体和目的片段扩增产物的使用量和比例？

A：载体使用量应大于 0.01 pmol，推荐使用量 0.03 pmol；克隆载体与目的片段摩尔比应在 2:1-1:5 范围内，最适为 1:2-1:3，超过范围可能会影响克隆效率。

Q：线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗？

A：会。线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，会产生较高的假阳性或抑制反应。建议割胶回收纯化产物。

Q：试剂盒里面的载体可以用吗？抗性是什么？同源重组克隆试剂盒会提供终载体吗？

A:可以用，线性化载体是通过反向PCR 方式制备。氨苄抗性。不提供终载体。

Q：最小可以插入多小的片段？最大多少？

A：最小建议 100bp 以上，过短的片段可能会被核酸外切酶完全切除掉。最大 10kb， 一般片段越大，难度系数更高些。

Q：一步法快速克隆试剂盒对感受态细胞有要求吗？是否必须搭配翊圣的感受态细胞？是否可以用电转的方法？

A：不是必需搭配。推荐使用转化效率为 107 cfu/μg 以上的感受态细胞。如 Yeasen的 DH5α（cat NO. 11802ES），TOP10（cat NO. 11801ES）等。可以电转，但要用电转感受态。

Q：想同时进行多个基因表达，能否用同源重组法？

A：可以用。常用多顺反子元件载体，将多个 ORF 串联起来，同时表达多个基因。而 IRES 元件和 2A 多肽元件是最常用的。