近日，武汉大学周翔、田沺教授团队在国际顶级期刊《Nucleic Acids Research》（IF=13.1）上发表了题为“Harnessing a single molecule for dual bioorthogonal regulation of RNA function and m6A methylation” 的突破性研究成果 ——CliPEdit 策略，首次在单一分子上实现生物正交连接（Click OFF）与光控切割（Light ON）的双功能调控，为复杂生物系统中 RNA 多位点动态调控开辟全新路径。

BANEIC修饰的sg-Gapdh在凝胶中表现出特征性的迁移率降低和条带展宽，t-DBCO处理后，修饰sgRNA发生交联，滞留在凝胶孔中，365 nm光照8分钟后，条带迁移率恢复至接近天然sgRNA水平。

使用FAM标记的R-21nt探针，在HEK293T细胞中实时观察调控过程，BANEIC修饰不影响RNA的细胞内行为；DBCO-Cy5处理后，仅BANEIC修饰的RNA显示Cy5荧光，证明点击反应高效发生；光照后Cy5信号显著减弱，证实光裂解成功。

图2. 介导RNA原位生物正交反应的调制策略验证（活细胞成像）

研究团队靶向多个内源性低甲基化位点：Actb A1216、Gapdh A690、Foxm1 A3488/A3504。

通过优化BANEIC修饰时间（3-7小时）和t-DBCO浓度（1-8 μM），结果如下：

SELECT和MeRIP-qPCR均显示：以上位点的m6A水平显著升高；而t-DBCO处理后，甲基化水平完全回归内源性基线；365 nm光照后，甲基化活性全面恢复，实现真正的ON-OFF-ON循环控制。

图3. CliPEdit策略调控dCas9介导的位点特异性RNA m6A甲基化

mRNA稳定性：Actb A1216位点m6A修饰显著降低mRNA稳定性，该效应可通过CliPEdit策略可逆调控。

蛋白表达：Foxm1位点甲基化导致FOXM1蛋白表达下调，t-DBCO"关闭"后蛋白恢复，光照"开启"后再次下调。

选择性调控多个RNA：共转染不同gRNA，可独立控制多个RNA位点的甲基化状态；对非靶向位点无影响，证明高特异性。

图4. CliPEdit策略调控M3M14 - dCas9介导的RNA m6A甲基化功能

该研究团队成功将CliPEdit策略应用于无需PAM序列的dCas13b-M3M14系统，同时在更短的crRNA上实现同等高效的甲基化调控，进一步验证了CliPEdit策略的普适性和模块化特征。